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大腸桿菌轉化
在構建或擴繁病毒質粒時，平板長出偏小或偏大的克隆，應該選擇哪種克隆進行后續實驗？
在使用Stbl3或TOP10感受態細胞構建或擴繁病毒質粒時，經常會看到在平板上長出偏小或偏大的克隆，我應該選擇哪種克隆進行后續實驗？ 答：我們推薦挑選直徑偏小的克隆進行后續實驗，Stbl3和TOP10菌株在構建或擴繁病毒質粒過程中都有可能產生末端重復區的錯誤重組（Stbl3菌株錯誤重組率約為30%；TOP10菌株錯誤...
可以用TOP10或DH5α代替Stbl3或Stable擴繁病毒質粒嗎？
可以用TOP10或DH5α代替Stbl3或Stable擴繁病毒質粒嗎？ 答：可以代替，Stbl3菌株和Stable菌株在病毒構建和擴繁過程中具有很低的錯誤重組概率，我們推薦在試驗中優先使用。普通大腸桿菌如TOP10或DH5α也可以擴繁病毒質粒，只是產量要低一些，并且在擴繁過程中容易產生錯誤重組，導致一些必要元件的刪除...
在使用Stbl3感受態時怎樣提高病毒質粒的產量？
在使用Stbl3感受態時怎樣提高病毒質粒的產量？ 答：Stbl3菌株基因組中核酸內切酶A1基因（endA1+）為野生型，沒有被突變。在質粒提取過程中，微量的endA1與質粒一起被提取，導致質粒降解。為了提高Stbl3菌株中的病毒質粒產量，可采用以下方法： A，使用商業化的高純度質粒提取試劑盒（推薦:QIAGEN #1...
同一批感受態細胞，陽性對照能長出密密麻麻的菌落，而連接產物轉化卻一個菌都沒長出來？
同一批感受態細胞，用含目的片段的T載體質粒轉化（陽性對照）能長出密密麻麻的菌落，而用另一種載體和目的片段的連接產物轉化，卻一個菌都沒長出來，重復了三次都這樣。請問這是感受態細胞的制作不過關，還是連接出了問題？哪個可能性大些？ 答：應該是連接的問題。所有連接反應建議同時轉化酶切后的質粒作為另一個陰性對照，確定酶切是否完...
感受態細胞放到-80冰箱了有半年了，還能用來轉化質粒嗎？
感受態細胞放到-80冰箱了有半年了，還能用來轉化質粒嗎？ 答：如-80冰箱儲存過程中沒有發生凍融的情況，是可以用來轉化的，但是由于凍存時間過長，轉化效率會有所下降，如果用于普通的質粒重轉或TA克隆等高效連接體系也是可以的，如珍貴的樣品請選用較為新鮮的感受態細胞。
涂布Amp板后，有很多衛星菌落，單菌落長不大
涂布Amp＋板后，總是有很多衛星菌落，單菌落長不大。 答：Amp抗性板鋪板密度過高或培養時間過長都會導致出現對Amp敏感的衛星菌量，因此涂布Amp抗性板時菌密度應適當降低，同時37℃培養時間不超過20h。另外推薦選擇培養基中使用羧芐青霉素代替氨芐青霉素(Amp)，并將抗生素濃度提高到100μg/ml，可使情況改善。
轉化后大量長菌，呈長融的態勢
連接產物轉化后大量長菌，完全是一種長融的態勢，在轉化前感受態DH5α在Amp＋，Kan＋中都未能搖起來，說明感受態沒有被污染，這是為什么？ 答：每次實驗中都應設有陽性對照以估計轉化效率，設立陰性對照已消除可能的污染及查明失敗的原因。出現上述情況，可能是菌量過多或者感受態細胞在操作過程中污染。請先確定不加DNA只有感受...
